蛋白表达纯化第一步：质粒构建

        研究一个蛋白质的第一步是拿到它准确的基因序列，有了基因序列，我们就可以构建合适的质粒，表达出所需要的蛋白。

        质粒构建，英文名为plasmid construction。选定的目的外源基因（DNA）先要经过PCR扩增。随后用限制性内切酶分别切割载体和外源DNA片段，再使用DNA连接酶将切割后的载体与DNA片段连接，转入宿主细胞。最后经过筛选鉴定出正确的重组克隆质粒，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

图一：质粒构建流程示意图

1、如何选择载体？

       载体通常分为克隆载体（Cloning Vector）与表达载体（Expression Vectors）两种。

       克隆载体大多是高拷贝载体，能够将外源基因与克隆载体的质粒连接，导入原核细菌内，进行大量复制克隆。主要用途是保存目的基因片段。

在选择克隆载体时应注意：

       ①具有自主复制能力，拷贝数高；

       ②携带易于筛选的选择标记；

       ③含有多种限制酶的单一识别序列，以供外源基因插入；

       ④载体应尽可能小（＜15kb），便于导入细胞和进行繁殖；

       ⑤使用安全。克隆载体应只存在于有限范围的宿主内，在宿主体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状，并且不能离开工程宿主自由扩散。

       表达载体是为了使插入的外源DNA序列转录、翻译成多肽链而进行特殊设计的克隆载体。它含有特定的表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号。

根据表达的类型，表达载体可分四类：

       非融合型表达载体，如PKK223-3；

       分泌型表达载体，如PINⅢ-ompA1；

       融合蛋白型表达载体，如PGEX；

       包涵体型表达载体，如pBV220。

图二：基因片段选择

 2、引物设计中的规则

       运用PCR扩增目的基因的过程中，引物设计十分关键，以下是需要注意的：

       ①引物长度最好在18-30bp左右，常用的长度是 20-22bp；

       ②引物 Tm 值最好在 60℃ 左右，两条引物间 Tm 值要保持接近，相差最好不要超过 5°C；

       ③GC 的含量标准通常为 40%-60% 或45-55%；

       ④引物自身不应含有连续超过4个的互补的碱基，避免形成发卡结构或形成引物二聚体；

       ⑤引物的3' 端要避免出现连续重复的碱基，如 GGG 或 CCC ，这会导致错配的发生，最后一个碱基最好是 G 或 C；

       ⑥在引物的 5′ 端添加酶切位点时（在不影响扩增的特异性的前提下），根据酶切位点序列，需要添加不同种类和数量的保护碱基，通常多加3个碱基即可满足保护酶切位点的需求；

       ⑦上下游引物最好加入不同的酶切位点，相同的酶切位点可能导致目的基因片段出现倒置连接现象，影响基因序列的正常表达。

3、PCR扩增中常见的问题

        扩增基因的过程并不困难，但未必能保证百分之百的成功率。

        如结果出现引物二聚体、非特异性条带（大小不对）的现象，可以通过降低模板和引物的浓度、降低镁离子浓度、适当减少酶量，提高退火温度，来提高扩增特异性。

       若出现凝胶条带弥散状态，多为模板不纯、反应体系中各成分比例不合适、退火温度设置偏低、循环次数过多等原因。

       长片段基因的扩增容易增加点突变和错配率，选用高扩增能力、高保真、可靠性强的聚合酶也很关键。

4、其他问题

       在操作酶切连接的步骤时也要定性定量，保证酶活性充足，例如：双酶切尽可能选择同种缓冲buffer，一般用量40U单位以上（用量不超过总体积1/10），保证酶切过程充分；可根据 目标片段量（ng）=(载体量（ng）×目标片段长度（kb）)/(载体DNA片段长度（kb）)×目标片段和载体的摩尔比（1：3-1：8）计算出目标片段和载体的加入量，提高连接效率。

       构建好的载体放入感受态细胞中转化（TOP10、DH5α、BL21等，感受态细胞在使用时尽可能保证新鲜，避免反复冻融，冰上孵育和热激时间应严格控制），经抗性、菌落PCR、酶切、测序等多道程序验证，确定是否转化成功，最终获得正确的重组克隆基因片段。

5、如何选择正确的菌株和载体（详见文末列表）

E coli strain list

Plasmid list

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