在生物化学和分子生物学领域,分子互作实验是揭示生物分子结构和功能的重要手段。对于初入科研领域的新人来说,了解和掌握这些实验方法至关重要。
一、蛋白质-蛋白质分子互作实验
免疫沉淀(IP)
原理:利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合,以及细菌蛋白质的“Protein A/G”特异性结合到抗体的Fc片段,从而富集和纯化目的蛋白。
应用:用于目的蛋白的定性和定量分析,是抗原检测和纯化的常用方法之一。
免疫共沉淀(Co-IP)
原理:基于IP反应捕获和纯化靶蛋白,如果样品溶液中存在与靶蛋白相互作用的目的蛋白,也会被一同捕获及纯化。
应用:研究体内蛋白质间的生理性相互作用,确定两种蛋白质在完整细胞内的相互作用。
GST Pull-down
原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽琼脂糖磁珠上,作为诱饵蛋白,捕获与之相互作用的目的蛋白。
应用:验证两种已知蛋白质可能存在的直接相互作用,或寻找可能与目标蛋白存在相互作用的未知靶蛋白。
Far-Western Blotting
原理:将靶蛋白固定在膜上,用诱饵蛋白作为探针去检测膜上的靶蛋白,再利用特异性抗体孵育、检测。
应用:体外检测蛋白间相互作用,验证已知蛋白间的相互作用,或分析已知蛋白和未知蛋白间的相互作用。
二、蛋白质-RNA分子互作实验
RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation)
原理:用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白,免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。
应用:检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间的相互作用。
RNA Pull-down
原理:使用体外转录与生物素标记RNA,与细胞或组织的提取液进行孵育,形成RNA-蛋白质复合物,再通过磁分离与孵育液中的其他成分分离。
应用:研究IncRNA、circRNA与蛋白质之间的相互作用。
三、蛋白质-DNA分子互作实验
染色质免疫共沉淀(ChIP)
原理:在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为染色质小片段,通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。
应用:检测与蛋白结合的DNA序列,研究转录因子或组蛋白修饰。
四、蛋白质-DNA/RNA互作实验
凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)
原理:基于蛋白-探针(DNA或RNA)复合物在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理,检测蛋白质与核酸的相互作用。
应用:定性和定量分析DNA结合蛋白和其识别基序的直接相互作用,也可用于研究蛋白-RNA互作。