MicroED（微晶电子衍射）技术是晶体学领域的一项颠覆性技术, 在 2018 年被《Science》杂志评选为年度十大科技突破之一。其主要通过电子束对微小的晶体进行衍射，然后收集衍射数据并进行结构解析。由于MicroED的独特优势，除了生物大分子之外，对化学小分子、天然产物、药物制剂的研究也很合适。
MicroED 简介
传统结构生物学中的X射线衍射手段有着对晶体结构的较高要求（一般需要>10μm就可），而大晶体的培养通常难度高、耗时长、不确定性大，而且很多分子只能形成纳米级别的晶体。
MicroED是基于冷冻电镜而发展出的前沿技术。相比于 XRD 技术，MicroED 采用高能电子束，可以直接使用纳 米级微晶收集数据、鉴定结构，从而极大缩短了结构研究中最耗时费力的湿实验的流程，节约实验成本，优化实验结果。
图1. MicroED原理
MicroED的原理类似于X射线晶体学。电子波同X射线一样，照射到类似晶体的样品上时也能够发生衍射现象。当中间镜的物平面位于物镜的后焦面时，将在荧光屏上得到经中间镜和投影镜放大了的电子衍射谱，即为透射电子显微镜的衍射模式。在实际的透射电子显微镜中，成像模式和衍射模式的中间镜电流已设置好，通过相应按钮（Diffraction按钮）即可实现两个模式的切换。MicroED对结构生物学领域起到了很好的补充。
表1. SCXRD 和 MicroED 技术对比
实验流程
1.样品制备
挑选合适大小的蛋白晶体，如晶体尺寸大于1um，需要使用冷冻离子束对蛋白晶体进行切割，获取薄厚适当的晶体切片，最佳尺寸在几百纳米左右。
2.数据收集
将载有样品的电镜载网插入电镜中，将电子束对准微晶，连续旋转微晶以收集电子衍射数据。
3.数据处理
用标准X射线晶体学软件对这些数据进行处理、解析和精修，最后得到精确的晶体结构。
应用案例
▶ IL5RA-AF17121多肽复合物
IL-5是Th2细胞分泌的细胞因子，参与调控嗜酸性粒细胞的功能，与T2-低哮喘和高嗜酸性粒细胞综合征有关。IL-5与IL-5受体结合可激活IL-5发挥作用，因此干扰IL-5受体的激活成为大家研究的方向之一。
AF17121是IL-5的抑制性多肽，在2019年被报道与IL-5受体的α亚基（IL5RA）结合，从而抑制IL-5与IL-5受体的结合。
「青云瑞晶」利用 MicroED 三维电子衍射技术成功解析了 IL5RA-AF17121 多肽复合物结构。
图2. Cryo-FIB和MicroED衍射图 （A）10μM大小的晶体；（B）晶体铺到铜网并用Cryo-FIB切成200nm薄片；（C） MicroED收集衍射数据
根据收集到的衍射数据结合软件解析IL5RA-AF17121多肽复合物的结构，分辨率为3Å。
图3. IL5RA-AF17121复合物结构
▶ HIV-1蛋白酶与制剂的结构
在HIV病毒成熟期间，HIV-1蛋白酶会切割Gag蛋白，从而组装出成熟的HIV病毒。因此，潜在的治疗策略是阻断Gag与HIV-1蛋白酶的相互作用。小分子抑制剂bevirimat就是设计用来抑制HIV-1蛋白酶的的活性的，但由于足够尺寸的晶体样品获取困难，用X射线晶体学的方法不能解析HIV-1-Gag-bevirimat的共晶结构。蕞终通过MicroED解析了HIV-1-Gag-bevirimat共晶的结构。
该结构揭示了bevirimat和蛋白之间的静电和疏水相互作用，为基于结构的药物设计和开发出更有效的抑制剂供了基础。
图4. 用MicroED技术解析的HIV-1-Gag-bevirimat结构[1]
▶ GPCR蛋白A2AAR
膜蛋白的结构解析一直是困扰学术界的难题，Lipidic cubic phases (LCP)技术能够帮助膜蛋白进行结晶，因此极大的促进了膜蛋白晶体学的发展。但用LCP技术长膜蛋白晶体往往长出的是微晶，晶体尺寸达不到XRD收集的要求，却十分适合MicroED技术。
下图便是MicroED技术解析的GPCR蛋白A2AAR。A2AAR是一种重要的潜在药物靶标，研究表明，其与肿 瘤、帕金森病、药物成瘾和精神疾病等有重要关系。
图5. MicroED技术解析的膜蛋白A2AAR结构[2]
▶ 化学小分子及天然产物案例
除了生物大分子之外，MicroED对化学小分子、天然产物、药 物制剂的研究更加合适。因为化学小分子呈现粉末状，尺寸上与其的研究范围非常契合，很多利用MicroED研究化学小分子的成功案例都验证了此技术的高 效性和应用性。
✅ 粉末样品结构解析
MicroED对所解析晶体的尺寸要求极低，所以针对一些很难培养大尺寸单晶的药物，我们可以直接从粉末中挑选合适的微晶颗粒。晶体的最小维度尺寸只需大于100nm ，即可使用MicroED进行结构解析。
✅ 共晶药物结构解析
该共晶药物两种配体通过氢键结合，常规单晶培养手段会导致氢键解离。使用MicroED对粉末药物进行原位结构解析并确认分子的绝对构型，确定了该共晶药物的结构以及两种配体的比例。
✅ 解析小分子绝对构型
MicroED发射的电子束与药物分子中的原子相互作用，获得的电子衍射图谱具有较强的动力学效应，手性不同动力学效应不同。动力学精修可以确认手性化合物的绝对构型，避免错误的手性产生不同的生物学效应。
MicroED 等结构解析技术平台
「青云瑞晶」提供专业的结构解析技术服务，自拥有单晶X射线衍射（XRD）、冷冻电镜单颗粒法（CryoEM-SPA）、MicroED 三种结构解析技术平台，根据蛋白质的不同性质，提供不同的解决方案，结合精良高端的实验设备、经验丰富的高学历科研团队，为您提供从蛋白表达开始的一站式结构解析服务，灵活多样化满足您的多种科研及工业界需求。
服务优势
✅先进的技术与平台
国内首家MicroED商业平台，先进的电镜设备配合自主研发软件，获取最好的结构数据。
✅北大专家领衔团队
国内最权威的MicroED领域专家带队，保证项目顺利进行。
✅提高晶体解析成功率
针对10微米以下尺寸蛋白晶体的解决方案，破解更多蛋白质结构。
参考文献
[1] PURDY M D, SHI D, CHRUSTOWICZ J, et al. MicroED structures of HIV-1 Gag CTD-SP1 reveal binding interactions with the maturation inhibitor bevirimat [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018, 115(52): 13258-63.
[2] MICHAEL W. MARTYNOWYCZ A S, ET AL. MicroED structure of the human adenosine receptor 2 determined from a single nanocrystal in LCP [J]. biorix, 2020.
