前言

 

锌指抗病毒蛋白（ZAP）是宿主识别病毒CpG二核苷酸的“哨兵”，但是它自身不具备酶活性，需要招募搭档执行 RNA 剪切。KHNYN被证实是ZAP限制多种病毒所必需的结合蛋白，其序列中包含一个推测属于PIN核酸酶超家族的结构域。然而，此前研究检测到该结构域极其微弱且无序列特异性的切割活性，这与KHNYN在抗病毒中不可或缺的地位形成显著矛盾。

 

因此，KHNYN究竟如何发挥其核酸酶功能、其活性是否受特定因子调控，以及其切割是否具有底物选择性，成为理解ZAP通路分子机制的核心未解问题。

 

近日，来自弗朗西斯·克里克研究所、伦敦国王学院、阿斯利康的研究人员发现，KHNYN的扩展PIN结构域并非以往认知中的弱活性核酸酶，而是一种严格依赖锰离子（Mn²⁺）的高效内切核糖核酸酶，并在ApC、ApA和UpA序列处表现出切割偏好。

 

通过解析KHNYN的晶体结构，发现其PIN结构域含有一个独特的N端结构臂，该结构域以锰离子依赖性方式特异性切割RNA。这一结构发现解释了其高效抗病毒活性的分子基础，解决了此前对其弱酶活性的矛盾认知。

 

这项研究除常规的生化表征外，通过晶体结构解析进行了较为深入的机制研究，高质量的结构生物学工作，为这项研究提供了最坚实的证据和最深度的机制洞察，从而使其达到了高水平期刊的发表门槛。

研究以“KHNYN is a manganese-dependent endoribonuclease required for ZAP-mediated antiviral restriction”为题发表在《Nucleic Acids Research》上。

 

 

 

研究内容

1. 严格依赖 Mn²⁺的内切核糖核酸酶

通过AlphaFold与多序列比对，发现KHNYN较ZC3H12家族多出一段N端延伸（V410–Q434）。构建核心PIN与扩展PIN表达体系，发现仅后者可溶且单分散，说明N端结构臂是蛋白稳定的关键。

 

图1. ZAP和KHNYN中的结构域

 

NanoDSF分析显示，Mn²⁺能显著提高蛋白熔化温度（Tm），而Zn²⁺等则导致不稳定。

 

图2.KHNYN的稳定性

 

将活性中心的四天冬氨酸基序突变（D524A/D525A）后，酶活完全丧失。

 

图3. KHNYN内切核酸酶活性

 

2. ex-PIN的作用机制与活性调控

 

ex-PIN仅切割单链RNA，不切割DNA，且在ApC、ApA和UpA处具有序列偏好性，对ZAP识别的CpG位点切割效率低。

 

图4. KHNYN内切酶的特异性

 

生理浓度较高的Mg²⁺和Ca²⁺是ex-PIN的竞争性抑制剂，能在Mn²⁺存在时剂量依赖性地抑制切割活性，这解释了细胞如何避免酶活被非特异性激活。

 

图5. KHNYN内切酶金属离子抑制作用

 

3. 结构基础：N端结构臂的关键作用

晶体结构揭示了一个先前未知的N端结构臂，其像“安全带”一样包裹核心结构域，通过大量相互作用稳定整个蛋白折叠。

 

图6. KHNYN的ex-PIN结构域结构

 

活性中心的四天冬氨酸基序在无底物状态下已基本形成“预组织”构象，为快速响应Mn²⁺与底物结合做好准备。

 

图7. KHNYN PIN结构域活性位点

 

4. 细胞水平的抗病毒功能验证

在细胞实验中，删除N端结构臂或催化双突变均使KHNYN完全丧失对CpG病毒的抑制能力。用同源蛋白N4BP1的PIN结构域替换KHNYN的ex-PIN，嵌合体仍保留抗病毒活性，表明该催化模块的功能在不同蛋白间是保守的。

 

图8. Ex-PIN结构域突变体及其抗病毒活性

 

总结

本研究的核心发现是揭示了KHNYN并非一个作用微弱的配角，而是一个严格依赖Mn²⁺的高效RNA内切酶，对ApC、ApA和UpA具有切割偏好性。这一发现彻底更新了我们对ZAP-KHNYN抗病毒复合体降解病毒RNA的认知：ZAP负责识别并锚定富含CpG的RNA，而KHNYN则作为被Mn²⁺激活的“分子剪刀”，在邻近的特定序列位点进行精准切割。

 

通过原子分辨率晶体结构，研究首次可视化其独特的N端结构臂如何稳定催化核心，并从三维层面阐明其活性位点的金属结合特征，将抽象的生化机制转化为可观测的结构基础，推动了对其抗病毒功能的深入理解。