蛋氨酸腺苷转移酶2A

研究背景

蛋氨酸腺苷转移酶2A(MAT2A)是蛋氨酸循环中的一种限速酶,同时也是被公认的癌症治疗靶点。目前公开报道了许多MAT2A抑制剂,有三种已经进入临床试验阶段,用以治疗MPAP片段丢失导致的实体瘤或淋巴瘤。GSK、辉瑞、Agios等诸多药企都针对该靶点进行过研究开发。

难点

单体的MAT2A酶不能进行催化作用,因为该蛋白在单体状态下无法形成完整的活性位点。在形成二聚体后,蛋白的两个单体各自贡献出一半残基形成完整的活性位点。
想要针对MAT2A靶点筛选抑制剂,需要得到贴近人体内环境的,形成二聚体的蛋白。

分析

常规的原核蛋白表达系统,只能表达出单个的MAT2A蛋白,不用用于活性检测。

难点

最终选择在昆虫细胞表达系统里进行了MAT2A蛋白的表达,经分子筛验证成功得到了二聚体蛋白。并且解析了1.8Å分辨共晶结构。
图片1
图片2

KRAS G12D

研究背景

KRAS是一种膜结合GTP酶,被认为是 GDP-GTP 调节的开关。RAS家族(KRAS、NRAS、HRAS)是人类癌症中最常见的致癌原因之一,KRAS基因突变占RAS基因突变总数的86%。2021年安进(AMGEN)获FDA加速批准的KRAS G12C抑制剂Lumakras(sotorasib)上市。目前全球布局 KRAS抑制剂已申报临床十余种,其中四款进口药物,七款国内药物。

难点

KRAS 与GTP结合,处于激活态;与 GDP 结合,处于“关闭”状态,通过这种状态的转换来调节细胞质信号网络并控制各种正常的细胞过程。
想要研究该靶点,需要得到激活和关闭两种状态的蛋白。

分析

GTP转化为GDP是一个极快速的过程,Kras与GTP结合形成的激活状态很难获得。

解决方案

我们用酶降解了KRAS结合的GDP,然后加入GppCp与KRAS蛋白孵育,从而拿到激活状态的KRAS蛋白。最后解析了KRAS G12D-GDP/GppCP,KRAS G12D-GDP-1133高分辨的结构(~1.8Å)。
图片3
图片4

PROTAC 药物

研究背景

PROTAC中常用的E3连接酶有MDM2、cIAP1、VHL和CRBN。目前进入临床的PROTAC,用到的主要是VHL和CRBN。CRBN是cullin-4-containing E3泛素连接酶复合物CUL4-RBX1-DDB1中的一部分,常用配体为度胺类衍生物,该类衍生物分子量小、成药性好的特点使该蛋白复合物成为目前研究最多的PROTAC连接酶。Arvinas、Kymera、Nurix和C4都已经有管线进入临床期,国内也有许多药企处于follow的状态。

难点

PROTAC中常用的E3连接酶主要是VHL和CRBN。CRBN是Cullin-4-containing E3泛素连接酶复合物CUL4-RBX1-DDB1中的一部分,因其分子量小、成药性好使得该蛋白复合物成为目前研究最多的PROTAC连接酶。
CRBN-DDB1复合物比较大,长出靶点 - PROTAC分子 - E3连接酶复合物的晶体比较困难。VBC有三个蛋白,需纯化出比例1:1:1的复合物才方便开展结构生物学研究。

解决方案

用大肠杆菌表达系统重组表达纯化了VBC (ElonginB/C, VHL)复合物,用昆虫表达系统重组表达纯化了CRBN-DDB1复合物,用于靶点 - PROTAC分子 - E3连接酶的结构研究。
图片5