冷冻电镜 CryoEM SPA

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青云瑞晶冷冻电镜CryoEM-SPA

什么是冷冻电镜技术?
随着结构生物学的发展,基于结构的药物设计已经成为新药的主流开发模式(即根据靶标蛋白结合位点的结构来筛选潜在的结合分子)。冷冻电镜单颗粒技术(CryoEM-SPA),一种在低温状态下使用透射电子显微镜观察样本的显微技术,受到了越来越多的关注,并将逐渐比肩或超越传统晶体衍射技术,在生物学、医学、药物开发中发挥至关重要的作用。


技术简介
冷冻电镜单颗粒法的工作原理
      冷冻电镜单颗粒技术利用电子散射机制,通过低温冷冻而大大降低了高能电子束对分子结构的损伤,而后通过将散射信号转换为数以万计的单颗粒图像并依此进行三维结构重构。近年来,冷冻电镜的技术手段被不断提升,能够确定的分辨率也越来越高,实现了生物大分子的近原子级分辨率。冷冻电镜单颗粒法已经成为了解析各种蛋白分子结构的常规手段,与X射线晶体衍射和核磁共振共同构成了高分辨率结构生物学的基础。

图
技术优势
为什么选择冷冻电镜单颗粒法
  
  •   快速冷冻制样处理,可使样本保持近自然水合状态;

  •   无需结晶,可解析业界难点膜蛋白

  •   微克级样品需求,对蛋白纯度耐受性高

  •   允许检测同一靶蛋白的多种构象
     
  •   可解析大型蛋白复合物的结构

服务优势
为什么选择青云瑞晶
1、青云瑞晶提供从基因合成、蛋白表达到冷冻电镜结构解析的一站式定制化服务,拥有专业的蛋白生产、纯化团队和电镜专家团队;
2、青云瑞晶自拥有200kV冷冻电镜平台,配备Vitrobot冷冻机器人,同时与国内外多家机构深度合作,拥有充足的300kV冷冻电镜商业机时;
3、青云瑞晶提供及时响应、随时沟通的程序化服务,方便客户定制方案、掌握项目进展、拿到期望的结果。

服务流程
流程图

1.   蛋白样本:客户可选择直接提供蛋白样本,或指定特定蛋白,由青云瑞晶进行蛋白的表达、纯化过程;
2.   负染检测及评估:一种简单快速的评价样本质量的方法。将重金属染色剂应用于样本,增强对比度,可以快速可视化地进行样本质量初步评估。这一步骤中主要评估样本的均匀性(蛋白/复合物状态)、分散性、蛋白质/复合物的大小和形状、蛋白质浓度(观察颗粒分布情况)。
3.   冷冻制样及评估:在制备冷冻样品之前应确保样品经过完备的生化提纯过程,以具备较低的结构异质性;同时还要保证蛋白分子活性。冷冻制样通常将微量样本(3-5μl)交由Vitrobot进行处理,制备出一层极薄的分子溶液层,并由液乙烷快速冷冻。冷冻后,样品中的水分子不会形成结晶冰 ,而会形成无定形(玻璃状)冰层。此时样本分子将较好地分布在冰层中。在开始采集数据前,仍需对冷冻样品进行诊断评估,包括蛋白浓度、分布、稳定性,冰层的质量、厚度、均匀度和载网的均一性。
4.   数据采集、处理:高度稳定的200kV及300kV冷冻电镜提供高通量、自动化的数据收集。这一过程中透射电镜将采集数万张至数百万张高分辨率单颗粒图片,并由特定的算法程序进行数据整理。
5.   三维重构、模型建立:大分子的三维重构依赖于对数以万计的颗粒图片进行平均,这个过程中数据需要经过多步处理,需要调用适当的计算资源。在分析结构前,需要进行完好的数据基础存储架构,用来支持可生成TB级数据的冷冻电镜设施。三维重构的核心是软件算法,可用于测定及整合每一张照片的诸多参数,如空间取向,而后才能将二维的图片整合重构为三维的模型。