期刊：Journal of Medicinal Chemistry
DOI：10.1021/acs.jmedchem.6c01896
泛素化药物研发，靶点不止 E3
泛素化的过程首先由E1激活酶激活泛素，随后将其转移给 E2结合酶，最终在 E3连接酶的参与下，将泛素连接到底物蛋白上。在泛素化相关的药物研发中，E3 泛素连接酶一直是重要的研究方向。一个关键原因在于，E3 往往决定了哪些蛋白能够被识别并发生泛素化。人体内存在 600 多种 E3 泛素连接酶，它们各自参与不同的底物调控过程，为针对特定疾病相关蛋白开展干预提供了机会。
不过，泛素化并不只有 E3 这一个干预入口。如果说靶向 E3 可以从底物识别和泛素连接环节入手，那么靶向 E2 则有机会直接干预泛素转移过程。E2 不仅负责携带活化的泛素，其催化位点还直接参与泛素转移所需的化学反应。因此，通过抑制特定 E2 的功能，也有可能阻断依赖该酶的后续泛素化反应，为相关药物研发提供另一种思路。
近期，一项发表于 Journal of Medicinal Chemistry 的研究便聚焦于 E2 泛素结合酶 UBE2D2。研究人员通过共价化合物筛选与 X 射线晶体学相结合的策略，发现了能够结合 UBE2D2 的新型小分子 XY54，并进一步利用蛋白-小分子共晶结构指导化合物优化，获得了对催化位点 C85 具有更明确结合偏好的候选化合物 XY54-24。
这项研究为理解 E2 的小分子结合机制，以及利用结构信息开发相关抑制剂，提供了新的研究基础。
01 亲电试剂优先筛选锁定苗头化合物XY54
为快速发掘共价活性分子，研究团队采用亲电试剂优先筛选策略，对带有共价弹头的化合物库进行直接筛选。依托 DSF、ABPP 这两种成熟经典的生化筛选手段，团队最终鉴定得到骨架新颖的氨基噻唑类苗头化合物 XY54。
图1. 针对UBE2D2的共价化合物库筛选
为了确认XY54是否具有真正的口袋识别基础，团队通过X射线晶体学解析了UBE2D2 XY54 复合物结构，晶体电子密度清晰显示，XY54 同时共价修饰 C85、C111 两个半胱氨酸。
图2. UBE2D2-XY54复合物的共晶结构
同时，从结合模式发现，C85 口袋在酰胺取代区域留有空余空腔；而C111 周边氨基酸排布紧凑，空间很小。这种口袋环境的差异，为后续位点选择性改造提供了结构依据。
02 共晶结构指导优化，提升位点选择性与结合亲和力
C85位于催化口袋内，是抑制中间体E2~Ub形成的关键位点，而C111位于蛋白表面，是非催化位点。因此共价抑制剂的优化目标是保留并增强C85结合，同时削弱C111的结合。
图3. 针对XY54的酰胺基与酯基进行结构引导修饰的策略示意图，旨在提高其对C85的选择性与结合亲和力，同时降低对C111的结合。
研究人员根据共晶结构展现出的口袋差异，分两轮对XY54进行了理性优化改造。
第一轮改造聚焦酰胺侧链。通过在酰胺氮上引入不同取代基团，以实现“C85 口袋可以接纳该侧链，C111 口袋产生空间位阻冲突” 的目标。经过多批衍生物合成与生化活性评价，发现带有对羟基苯乙基取代的XY54 19综合表现最优。
图4. XY54-19优先结合于UBE2D2的C85位点
第二轮改造针对甲酯基团。XY54 19 自带的甲酯基团容易水解，存在代谢短板。研究人员将酯基替换为一系列 N 取代酰胺，筛选适配 C85 口袋的最优基团。构效数据表明，只有体积小巧的小环酰胺可以很好适配口袋，其中环丙基酰胺衍生物 XY54 24性能最佳。
图5. 通过酯基团修饰对XY54-19进行优化
生化测试结果显示，XY54 24针对C85的抑制活性相比原始苗头 XY54 提升近 10 倍；GSH 体外反应测试显示，XY54 24 弹头的本征巯基反应活性与临床共价药物阿法替尼相近，活性处于适中水平。针对 UBE2D 家族各亚型的平行评价表明，XY54 24 对 UBE2D2 的抑制活性优于 UBE2D1/3/4，表现出一定亚型选择性。
图6. XY54-24以UBE2D2 C85为靶点，并抑制其酶活性
图7. XY54-24对UBE2D家族蛋白的结合亲和力
03 细胞水平验证：抑制 A549 增殖并诱导凋亡
体外酶活实验证实，XY54 24 能够阻断 UBE2D2 泛素硫酯中间体形成，直接抑制 UBE2D2 酶催化功能。
进入细胞体系后，该分子可以穿透细胞，在胞内靶向 UBE2D2，剂量依赖性抑制 A549 肺癌细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡。共价抑制剂特征的洗脱实验验证：小分子与靶蛋白形成稳定共价加合物后，即便洗去游离药物，抑制效果依旧维持。搭配 siRNA 敲低实验进一步证明，化合物产生的细胞抑制作用部分依赖 UBE2D2 靶点，降低了表型来自非特异性毒性的可能性。
研究也客观指出先导分子的局限：活性仍处在微摩尔区间；同时人肝微粒体代谢半衰期短，距离适用于体内研究的高质量化学探针，还留有进一步优化空间。
图8. XY54-24可抑制A549细胞的增殖并诱导其凋亡
总结
这项研究以亲电试剂优先筛选结合X射线晶体学的手段，发现并优化得到了UBE2D2小分子配体XY54-24，其在细胞水平的实验结果证实，XY54-24能够抑制A549肺癌细胞的增殖。
在共价靶点开发中，DSF、ABPP 是快速验证小分子-蛋白互作、筛选活性苗头分子的经典手段，而共晶结构解析则是揭示结合模式、实现理性分子改造的核心利器。
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