冷冻电镜揭示多位点变构协同增强GPCR信号的机制

给一个靶点设计药物，研究人员通常会先盯上它与天然配体结合的那个位置。原因很简单：既然身体本来就有一套成熟的信号调控机制，沿着天然配体的结合方式去设计药物，自然是一个比较直接的思路。药物可以模拟天然配体，激活受体；也可以占据这个位置，阻止天然信号发挥作用。于是，正构位点成为许多 GPCR药物研发的重要起点。
但问题是，一个受体的活动，真的只能从这一个位置调节吗？
事实上，受体上还可能存在其他能够影响其功能的结合口袋，也就是变构位点。小分子不必直接与天然配体争夺同一个位置，而是可以从别处结合，通过改变受体的构象，影响它对天然信号的响应。尤其是正向变构调节剂（PAMs），它们能够增强天然配体引发的受体响应，这为药物设计提供了另一种思路：与其直接替代或阻断天然信号，不如尝试调节受体对天然信号的反应。
而最近一项针对多巴胺 D1 受体（D1R）的研究，又把这个思路向前推进了一步：如果一个受体上有多个变构位点，能不能让不同的小分子各自占据一个位置，再协同发挥作用？

研究人员利用冷冻电镜解析了多个变构调节剂与 D1R 的结合结构，发现三种小分子可以同时占据受体上三个不同的变构口袋。在功能实验中，三者协同作用使多巴胺的功能效价指标提升超过 1000 倍。

这意味着，研究人员不仅找到了天然配体结合位点之外的调控空间，还发现了多个变构位点协同影响受体活性的可能性。药物设计的思路，也因此多了一种值得探索的方向。

三药联用，信号放大超千倍

团队通过对先导化合物 MLS6585 进行药物化学优化，得到两个全新 D1R 正向变构调节剂：UNC9815、UNC10062。结合已报道的 LY3154207、BMSA1，在 βarrestin 招募、Gs 蛋白激活等多个细胞功能体系开展实验，最终发现：

单独使用任意一款PAM，都能够剂量依赖性提升多巴胺的激活效力（降低 EC₅₀），并且药效会到达平台、趋于饱和。而当LY3154207、BMSA1、UNC化合物三类完全不同骨架的PAM 共同作用于 D1R 时，多巴胺的激动效力提升超过1000 倍。

图1. 三类 PAM 的功能协同与 D1R 复合物冷冻电镜结构

冷冻电镜结构：TM1-TM7 界面独特的 “上下堆叠” 模式

为了在原子水平上阐明多位点协同机制，团队解析了不同PAM组合结合状态下D1R–Gs复合物的冷冻电镜结构，分辨率达到2.44–2.65 Å。结构显示，三种PAM结合在三个空间上不重叠的位点：

位点1：LY3154207结合位点，在胞内侧胞内环 ICL2 上方，该位点在过往研究中已有报道。

位点2（下口袋）：BMS-A1结合位点，在TM1–TM7界面靠胞内侧、H8螺旋上方

位点3（上口袋）：UNC9815/UNC10062结合位点，位于 TM1‑TM7界面靠胞外侧，BMS‑A1 的正上方。

UNC9815 和UNC10062 虽然结合在同一个上口袋，但刚性骨架的UNC9815 相比UNC10062 向胞内方向多深入约 2 Å。

图2. 三个非重叠变构位点的结构与功能

团队进一步开展大量定点突变、簇突变实验，验证了两个新发现口袋的结合模式。发现当对上口袋关键残基做簇突变之后，原本的正向变构分子UNC9815，直接从激活增强的PAM 转变为抑制信号的负向变构调节剂（NAM）。口袋氨基酸残基的改变，可以反转调节剂的功能方向，这充分体现出GPCR 变构系统的高度可塑性。

PAMs多位点协同调控机制：活性态—稳定化活性态—超级稳定化活性态

结合冷冻电镜结构和分子动力学模拟，团队将D1R的激活过程划分为三种递进的构象状态：

激活态（Active state）：仅正构激动剂（多巴胺/SKF81297）结合时，受体虽然被激活，但胞内环仍然具备较高的构象柔性。

稳定激活态（Stabilized active state）：在激活态的基础上再结合LY3154207。LY3154207 主要作用是稳定ICL2 的螺旋构象，但胞内环 ICL3、TM7 上经典的 NPxxY 激活基序依旧高度灵活。

超稳定激活态（Super‑stabilized active state）：当LY3154207、BMS-A1与UNC系列三者全部结合时，情形发生质变：

在胞内端，多PAM的协同占据显著限制了ICL3的大幅度摆动，牢牢锁定NPxxY保守基序。即便体系中移除G蛋白，受体依然能够维持类似G蛋白结合时的激活构象。与此同时，BMS-A1还会破坏维持受体失活态的分子内氢键，促使TM6向外张开，打开G蛋白结合的胞内口袋，这一系列效果，是仅仅加入 LY3154207 单个 PAM 无法实现的。

在胞外侧，随着结合 PAM 数量增多，胞外环 ECL2 的柔性逐步降低。三个PAM 结合条件下 ECL2 构象被高度固定，收缩胞外前庭空腔，减慢正构激动剂的解离速度，进一步提升多巴胺的表观激活效力。

不同位点的PAM共同锁死受体激活构象，最终实现上千倍的信号放大。