前言

G蛋白偶联受体（GPCRs）是人类最重要的药物靶点之一，约34%的FDA批准药物通过调控GPCR功能发挥疗效。

然而，GPCR的结构研究长期以来受困于分子量小、构象不稳定等难题，面临巨大挑战。传统方法如T4溶菌酶融合、纳米抗体稳定化等虽有一定效果，但往往依赖大量实验筛选，效率低下。

近日，清华大学刘翔宇团队提出了一种名为 “Click Fusion” 的AI驱动融合蛋白设计策略，实现了对GPCR非激活态的稳定、激活态的锁定，并进一步用于构象特异性纳米抗体的筛选。该策略大部分构建优化工作主要通过计算机实现，减少了对大规模实验筛选的依赖。并且该策略可在短时间内完成从设计到验证的迭代，提高了构建效率。

两项研究成果分别以“De novo design of a fusion protein tool for GPCR research”和“Extracellular nanobody screening using conformationally stable GPCR variants”为题，先后发表于《PNAS》上。

研究内容

1. Click Fusion：非激活态GPCR结构解析的“通用钥匙”

1）非激活态融合蛋白设计流程

团队以目标GPCR的AlphaFold预测结构为模板，利用RFdiffusion从TM5/6 开始，逐步延伸并构建出一个融合蛋白（Clip）骨架。随后，使用ProteinMPNN为这个骨架设计氨基酸序列，再通过AlphaFold2或ESMFold对设计的序列进行结构预测，并以pLDDT分数评估结构合理性和连接区刚性，选择高 pLDDT 分数进入基因合成、蛋白表达与纯化。

图1. 模式流程图

2）应用成果

成功解析了M1毒蕈碱受体与拮抗剂阿托品复合物（M1R-Clip1）的冷冻电镜结构，分辨率3.3 Å，与AlphaFold预测模型高度一致，且与已知晶体结构没有显著差异。

图2. M1R-Clip1的结构分析结果

将该策略应用于长期缺乏非激活态结构的NMBR，成功获得NMBR-Clip2与拮抗剂PD168368的复合物结构，分辨率达3.4 Å。

图3. NMBR-Clip的结构分析结果

进一步展示了Clip的“可移植性”：将M1R的Clip1成功迁移至结构相似的5-HT₂BR，首次解析其与拮抗剂balovaptan的复合物结构（3.6 Å），体现了“即插即用”的设计理念。

图4. Click Fusion策略和5-HT2BR的整体结构。

2. 激活态锁定+纳米抗体筛选：打开药物开发新维度

1）激活态融合蛋白设计与验证

在第二项研究中，团队进一步拓展融合蛋白设计策略，锁定GPCR于激活态构象。通过将G蛋白α5螺旋（G11CT）与受体C端融合，并在TM5/6间插入设计蛋白，构建出无需激动剂即可维持激活态的M1R-G11CT。

实验表明，该构建体对激动剂iperoxo的亲和力提升约600倍，且冷冻电镜结构显示其在无配体条件下仍处于活性构象，为激活态GPCR的结构与功能研究提供了前所未有的工具。

图5. 工程化激活态GPCR构建体的设计与生化表征

图6. M1R-G11CT的结构揭示了其无激动剂的激活状态

2）构象选择性纳米抗体筛选

基于上述构象锁定平台，团队进行了状态选择性纳米抗体筛选，并提出了“细胞内正交筛选”策略。其核心思想是使用一对或多对“胞外结构完全相同、胞内融合蛋白不同”的受体（如M1R-Clip1与M1R-G11CT）作为诱饵，通过多轮交叉筛选，利用其胞内区的差异来“扣除”结合胞内的抗体，从而定向富集那些识别共同胞外表位的抗体。

通过这一精巧的筛选流程，成功鉴定出了多个具有构象选择性的纳米抗体。并通过冷冻电镜解析其与M1R的复合物结构，揭示其结合于胞外侧变构口袋，具备明确的构象选择性机制。

图7. 面向胞外纳米抗体的胞内正交筛选

图8. 纳米抗体–M1R复合物的结构

总结

本研究展示了AI在GPCR结构生物学与药物发现中的强大应用潜力。通过“click fusion”策略，我们不仅实现了GPCR非活性与活性状态的高效稳定与结构解析，还开发了一种新型的构象特异性纳米抗体筛选平台。这一方法具有快速、通用、可扩展的特点，为GPCR靶向药物的开发提供了强有力的工具，尤其适用于目前难以成药的GPCR靶点。

未来，该方法有望进一步推广至其他膜蛋白（如转运蛋白），并在结构生物学、抗体工程与药物筛选中发挥更广泛的作用。