G蛋白偶联受体 (GPCR) - GCGR

难点

膜蛋白的膜内区域具有广泛的疏水表面,从膜上解离下来后在极性的水溶液中难以稳定存在,因此无法使用常规的结晶方法获得其结构信息。
GCGR在蛋白制备阶段,表达量极低,无法完成后续纯化实验。 
在蛋白制样阶段,蛋白样品大多停留在载网支持膜上,而非支持膜孔的冰层中。 
蛋白样品存在较严重的取向优势。

解决方案

1、更换质粒的表达载体和蛋白的表达体系,提高蛋白表达量;并在表达过程中加入单克隆片段,增加复合物的稳定性。
2、在蛋白样品上样过程中,改变蛋白样品的浓度,尝试用其他类型的载网,最终使蛋白样品大量入孔。
3、增加冷冻冰层的厚度,在载网上铺设碳膜,平均不同取向的颗粒数,使蛋白颗粒的优势取向得到改善。
图片13
Glucagon-GCGR-Gs-Nb35
分辨率:3.7 Å
参考文献:Science 367, 1346 (2020)
GCGR与Gs互作的氨基酸位点
GCGR与Gs互作的氨基酸位点
 
glucagon-GCGR-Gs-Nb35的结构
glucagon-GCGR-Gs-Nb35的结构